单细胞数据中到底应该如何处理线粒体基因

Original 周运来单细胞天地 2022-06-07

分享是一种态度

作者 | 周运来

男，

一个长大了才会遇到的帅哥，

稳健，潇洒，大方，靠谱。

一段生信缘，一棵技能树，

一枚大型测序工厂的螺丝钉，

一个随机森林中提灯觅食的津门旅客。

什么是线粒体基因

线粒体是参与细胞凋亡启动和执行的主要细胞器之一。线粒体基因在大多数细胞中表达，其表达水平是细胞类型特异性的。也就是说这个也是和细胞类型及其状态有关系的。

为什么要处理

因为线粒体基因的高表达水平可能是:

样品质量差，导致大量细胞凋亡或裂解。
特定样本的生物学，例如肿瘤活检，可能由于代谢活动和/或坏死而增加线粒体基因表达。

凋亡细胞表达线粒体基因，并将这些转录产物输出到哺乳动物细胞的细胞质中。例如，当凋亡的细胞被放入正常的细胞悬液中，会检测到更多的线粒体基因。检测到的线粒体膜占总膜的百分比如图所示

线粒体是参与细胞凋亡启动和执行的主要细胞器之一。细胞凋亡的过程依赖于一系列信号事件，包括线粒体基因表达的增加和半胱天冬酶的激活。因此，我们在计算每个样本中源自线粒体基因表达的UMIs数量时，评估了独特转录本的比例。在> 80%活细胞的高质量样品中，我们只检测到低比例的线粒体细胞(约3%)。与预期的一样，在只包含20%活细胞(74%)的Digitonin高样本中，线粒体转录本的数量最高。相比之下，含有50%活细胞的样本只显示线粒体基因表达略有增加(5-7%)，这表明存活率确实与观察到的线粒体转录本数量相关。

被裂解的细胞或细胞膜被破坏的细胞释放它们的细胞质转录本，而线粒体转录本可能仍然保留在双膜结合的线粒体内。具有完整线粒体的裂解细胞可能被gems包裹，这也增加了检测到的线粒体转录片段的概率。

如何处理

一般我们建议卡到30%以内，当然还是要看这群细胞为什么会高。建议是不卡阈值直接做降维分群，然后按分群来看小提琴图，如果只有一个或几个细胞群有差异的线粒体转录上调和低总UMI计数，这个群最有可能代表一个死亡或频临死亡的细胞群。此时，再去不迟。

另外一点，我们注意到，cellranger3比cellRanger 2检测的MT（人的是MT开头的基因，其他物种主要找到相应的基因）高的细胞更多。这主要是因为：cellRanger3或更高版本具有比版本2中的cell calling算法更敏感，新算法基于EmptyDrops方法(Lun et al.， 2018)。这种方法可以检测到之前版本算法所遗漏的细胞，特别是死亡或垂死的细胞，RNA含量自然较低的细胞，或异质性样本中的细胞。

这就也是为什么我们会主动地看看细胞中MT基因表达的原因，选择从下游分析中排除这些细胞。而在cellranger count管道中，没有直接的方法可以排除线粒体丰富的细胞。但是，您可以使用下面两种方法中的任何一种来间接完成此任务。

Using Cell Ranger and Loupe Cell Browser

质量差的细胞通常有低总UMI计数，很少有上调基因(表明低总基因表达)，而只有MT基因过表达。例如，在下面的图中，您可以看到基于图形的聚类t-SNE图中聚类1(顶部的青色聚类)的基因表。与上述鉴定死亡细胞的标准一致，在这个群集中只有线粒体基因上调。对cluster 9中的细胞也进行了类似的观察。

下面的图显示，与其他细胞相比，Cluster1和Cluster19中的细胞的总UMI计数也很低。

您可以从一个cellranger count 输出文件中获得Cluster1和9中细胞的条形码。默认的分群结果(基于图)在Cell Ranger输出的“ANALYSIS”路径中。例如，在下面的图中，cluster 1和cluster 9的细胞高表达了MT。这些cluster的条形码可以在输出文件中找到:outs/analysis/clustering/graphclust/cluster.csv

您也可以使用Loupe细胞浏览器下载的非MT丰富细胞。为此，首先去除富集MT的cluster1和9。然后使用“导出”功能在Loupe Cell浏览器如下。

步骤2。使用cellranger reanalyze重新运行二级分析并生成一个新的cloupe文件，不使用MT高表达的barcode。要指定条形码，需要使用——barcodes选项。

Seurat

第二种方法就是我们经典的Seurat。第三方工具如Seurat可用于筛选线粒体基因表达率高的细胞。请在这里（http://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html）找到更多的信息。(章节“QC和选择细胞进行进一步分析”)

References

[1] 单细胞转录组||Seurat新版教程:Guided Clustering Tutorial: https://www.jianshu.com/p/03b94b2034d5
[2] https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360001086611-Why-do-I-see-a-high-level-of-mitochondrial-gene-expression-
[3] https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360026505392-Why-do-I-see-more-MT-enriched-cells-from-Cell-Ranger-3-compared-to-Cell-Ranger-2-
[4] https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360026508452-How-can-I-exclude-poor-quality-cells-such-as-cells-that-show-enrichment-of-MT-genes

往期回顾

cellranger更新到4啦（全新使用教程）

如果你对单细胞转录组研究感兴趣，但又不知道如何入门，也许你可以关注一下下面的课程